Katedra za medicinsku biologiju
Medicinski fakultet
Sveučilišta u Zagrebu
STANIČNA BIOLOGIJA
S GENETIKOM
Praktikum za studente stomatologije
1. Metode proučavanja stanice
Tehnike istraživanja stanice. Određivanje strukture stanica mikroskopom. Svjetlosni mikroskop. Razlučivanje staničnih struktura. Razlučivanje molekula (DNA, RNA, proteini). Autoradiografija. Imunohistokemija.
Priprema stanica i tkiva za mikroskopiranje: fiksacija, uklapanje tkiva, rezanje na mikrotomu, bojenje.
Eksperimentalni dio:
1.Upotreba mikroskopa
2. Priprema trajnih preparata (rezanje parafinskih blokova na mikrotomu, fiksiranje i bojenje)
3. Studij različitih tipova eukariotskih stanica svjetlosnim mikroskopom
4. Određivanje promjera vidnog polja
5. Mjerenje veličine stanica (eritrociti)
6. Izračunavanje stvarne veličine stanica
Trajni preparati: 1. Krv žabe
2. Glatki mišić
Pribor: Predmetna i pokrovna stakalca, filter papir, milimetarski papir, histološke iglice, mikrotom, alkohol, ksilol, hemalaun, eozin, posudice za bojenje, 2% otopina metilenskog modrila.
2. Primarna kultura stanica sisavaca in vitro
Kultiviranje stanica in vitro. Kultiviranje stanica sisavaca. Kulture stanica: primarne, linijske, sojevi stanica. Krivulja rasta stanične kulture. Kontaktna inhibicija.
Eksperimentalni dio:
1. Priređivanje primarne kulture ( jetra štakora)
2. Kultura tkiva
Tekst:
Crnek-Kunstelj V: Kultiviranje stanica in vitro i primjena u biomedicini. U: Osnove biologije stanice i genetike za medicinare. Zagreb, Medicinski fakultet, 1999.
Pribor:
Jetra štakora, škare, pincete, Erlenmeyer-ove posudice za priređivanje suspenzije stanica, Breed-Demeter bočice za kultiviranje stanica, Pasteurove pipete, plamenici, centrifuga, termostat, 0,5% otopina tripsina, medij za kulturu stanica sa serumom (MEM+serum), trypanblau, pribor za bojenje razmaza, Bűrker Tűrkova komorica za brojenje stanica, plastične epruvete, plastične šprice, metalna mrežica, stakleni klip šprice.
3. Građa i funkcija stanice
Oblik i funkcija stanica. Stanica kao elementarna jedinica funkcije. Prokariotske i eukariotske stanice. Elektronski mikroskop - moć razlučivanja finih staničnih struktura. TEM- transmisijski elektronski mikroskop, SEM - scanning elektronski mikroskop. Ultrastruktura staničnih organela.
Raznolikost stanica čovjeka. Priprema živih stanica za citološku analizu.
Eksperimentalni dio:
1.Priprema svježih preparata
2.Epitelne stanice čovjeka (bris površine jezika)
3.Razmaz kore velikog mozga štakora
4. Epididymis čovjeka (trajni preparat)
5.Imunohistokemijski signali
Pribor: Predmetna i pokrovna stakalca, filter papir, milimetarski papir, 2% otopina metilenskog modrila
4. Molekularna građa membranskih sustava, funkcija i transporti
Fiziologija i građa stanične membrane. Molekulska građa plazmatske membrane. Singer-Nicolsonov model tekućeg mozaika.Lipidi, fosfolipidi, integralni i periferni membranski proteini, kolesterol. Stanična membrana biljne i animalne stanice. Semipermeabilnost, difuzija, osmoza, dijaliza. Plazmoliza, deplazmoliza, hemoliza. Aktivni i pasivni transport kroz membranu. Cistična fibroza.
Struktura i funkcija mitohondrija. Oksidativna fosforilacija.Visokoenergetski fosfatni spojevi: ATP, ADP, AMP, cAMP. Ljudski mitohondrijski genom. Slobodni radikali kisika. Mitohondrijske bolesti. Struktura i funkcija kloroplasta.
Tekst:
Vlahović, M.: Struktura stanične membrane. U “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare”, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
Crnek-Kunstelj, V.: Principi transporta kroz membranu.U “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare”, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
Vlahović, M: Pretvorba energije u stanici. Citoskelet. U “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
Radić, K., Pećina-Šlaus, N. Cističnafibroza: molekularnabiologijaimogućnostiliječenja, Medicinar 42:49-53, 2000.
Eksperimentalni dio:
1.Studij semipermeabilnosti: najselektivnija membrana
2.Osmotsko ponašanje stanične membrane biljne stanice: plazmoliza i deplazmoliza. 3.Određivanje postotka plazmoliziranih stanica.
4.Svjetlosna mikroskopija fotosintetičke stanice (Elodea canadensis)
5.Cikloza: kruženje citoplazme s kloroplastima
6. Traubeova stanica
Trajni preparati:
1.Mitohondriji u stanicama jetre
Pribor:
Crveni luk (Allium coepa),
0,2%, 0,4%, 0,9%, 5% otopina NaCl
Kristali CuSO4, K4Fe(CN)6
Otopine 5% CuSO4, 4% K4Fe(CN)6 Razrijeđena HCl
Predmetna i pokrovna stakalca, urna stakla , epruvete, Pasteurove pipete, filter papiri
Vršni listići vodene kuge (Elodea canadensis)
Predmetna i pokrovna stakalca
5. Model eritrocitne membrane, bijeli duhovi
Membrana eritrocita sisavaca – najbolje definirana stanična membrana. Adenilciklaza, spektrin, ankirin, glikoforini. Mogućnost unosa lijeka u ljudske eritrocite.
Tekst:
Vlahović, M: Eritrocitna membrana. Intracelularni membranski transporti. U “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
1.Membrana eritrocita sisavca:
Rezistencija eritrocita prema anizotoničnim otopinama
Osmotska hemoliza
Eksperimentalni dio:
Izolacija membrana eritrocita: “bijelih duhova” (engl. white ghosts):
Dokazivanje makromolekula hemoglobina u eritrocitima
1.Odvajanje plazme od eritrocita
2.Dokazivanje proteina u plazmi
3.Hemoliza eritrocita
4.Taloženje membrana eritrocita (“bijelih duhova”)
5.Ekstrakcija lipida
6.Etersku fazu s lipidima obojiti Sudan crvenilom B
7.U vodenoj fazi dokazati proteine
Trajni preparat: razmaz krvi čovjeka
Pribor:
Predmetna i pokrovna stakalca,
Epruvete za centrifugiranje, uske duge epruvete za bojenje, epruvete za ekstrakciju
Stalci za epruvete, Pasteurove pipete, plamenici, iglice
Centrifuga, vaga za tariranje,
Fiziološka otopina, 0,2% NaCl, 0,4% NaCl, 0,9% NaCl, 5% NaCl
70% alkohol, eter
Dušična kiselina, ledena octena kiselina, otopina Sudan crvenila B
heparinizirana krv
6. Tok informacija u stanici
Centralna dogma molekularne biologije (DNA, RNA, proteini). Lamp-brush kromosomi, gorostasni kromosomi. Kondenzacija i dekondenzacija kromatina, aktivni kromatin. Interfazna jezgra – eukromatin i heterokromatin (fibroblasti).
Trajni preparati:
1.Fibroblasti čovjeka
2.Lamp-brush kromosomi (ovarij žabe dvospolca)
3.Gorostasni kromosomi
7. Izolacija DNA, priprema gelova za elektroforezu
Nukleinske kiseline, DNA i RNA. Genomska i plazmidna DNA. Principi izolacije. Ekstrakcija genomske DNA iz biljnog i životinjskog tkiva. Restrikcijske endonukleaze. RFLP, molekularni markeri.
Elektroforeza DNA. Priprema gelova za elektroforezu. Southern i Northern blot.
Elektroforeza proteina. Western blot.
Tekst: Bulić-Jakuš: Elektroforeza DNA u Primjena tehnologije rekombinantne DNA
Vlahović: Elektroforeza proteina u Frakcioniranje stanica
Eksperimentalni dio:
1.Ekstrakcija DNA iz jetre štakora
2. Ekstrakcija DNA iz biljnog tkiva (kivi)
3. Priprema gelova za elektroforezu
4. Nanošenje uzoraka na gel
5. Zadaci
Pribor:
jetra štakora, kivi
homogenizator, mrežice za filtriranje, šampon, sol, voda, 95% etanol, epruvete, stakleni štapići, led, kapaljke
agaroza, kadica za elektroforezu, ispravljač električne struje, transiluminator, mikropipete, bromphenol blue i xylencyanol, puferi, češljevi, kalupi, kvačice, ljepljiva traka
8. Faze staničnog ciklusa
Stanični ciklus eukariotskih stanica. Interfaza: G1, S, G2, M – G0. Regulacija staničnog ciklusa, restrikcijske točke. Faktori rasta i signalizacija.
Mitoza, dioba somatskih stanica. Profaza, metafaza, anafaza, telofaza. Priprema za mitozu: udvostručenje centrosoma, kromosoma i centromere. Diobeno vreteno. Citokineza: formiranje jezgrinih ovojnica.
Mitoza i rak: stanični ciklus i kemoterapija
Tekstovi:
Bulić-Jakuš, F.: Stanični ciklus. U: “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
Vlahović, M.: Mitoza, U: “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
Crnek-Kunstelj, V.: Stanična signalizacija. Stanični ciklus i kemoterapija, U: “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Zagreb, Medicinski fakultet, 2003.
Eksperimentalni dio:
1.Određivanje brzine dioba stanica – mitotički indeks
Trajni preparati:
1.Stanice u G0 fazi – neuroni čovjeka
2.Identifikacija svih faza mitoze u vršku korjenčića luka
3.Stanice sisavaca u mitozi: presjek kroz uterus štakora u ranoj trudnoći
4.Mitoze u malignim stanicama čovjeka: HeLa stanice
5. PCNA ( testis imunohistokemija)
9. Kromosomi čovjeka, citogenetika
Kromosomi čovjeka: struktura, oblici i klasifikacija. Primarna konstrikcija (centromera) i sekundarna konstrikcija (nukleolarni organizator)
Nukleosom: DNA i histoni. Nehistonski kromosomski proteini. Kromatinsko vlakno, uloga histona H1.
Kariotip čovjeka. Metafazni kromosomi i izrada kariotipa. Haploidan, diploidan i aneuploidan sastav kromosomske garniture. Kromosomske aberacije u čovjeka.
Spolni kromatin: Barrovo tjelešce
Tekst:
Cox TM i Sinclair J: Molekularna biologija u medicini, Zagreb, 2000. ; poglavlje 5: Načela medicinske genetike. Str 77-82
Crnek-Kunstelj, V.: Struktura i replikacija eukariotskih kromosoma. U: “Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Zagreb, Medicinski fakultet, 1999.
Eksperimentalni dio:
1. Kariotipizacija (studenti određuju slijedeće kariotipove):
Normalni ljudski kariotip: 46, XX i 46, XY
Klinefelterov sindrom: 47, XXY i Turnerov sindrom: 45, XO
Patauov sindrom: 47, XY, 13+ , Downov sindrom: 47, XY, 21+
Strukturna i numerička analiza kromosoma
2. Određivanje X-kromatina ili Barrovog tjelešca u stanicama bukalne sluznice
Trajni preparati:
1. Kromosomi čovjeka u kulturi periferne krvi
2. Kromosomi maligno transformiranih stanica čovjeka: HeLa stanice karcinoma cerviksa
3. Pruganje ljudskih kromosoma: G-pruganje
Pribor:
Metafazni kromosomi, “obrasci” za izradu kariotipa, drvene špatule, orcein, anisol
10. Mejoza, gametogeneza, oplodnja
Mejoza, faze mejoze, sinaptički kompleks. Gametogeneza: spermatogeneza i oogeneza.
Oplodnja i završetak mejoze. Kapacitacija. Muški i ženski pronukleus. Oplodnja in vitro u sisavaca.
Tekst:
Škreb, N. (urednik): Razvitak spolnih stanica, str. 1-8. Oplodnja i početak embrionalnog razvoja, str. 9-19. U Biološke osnove suvremene medicine, Školska knjiga, Zagreb 1991.
Vlahović, M.: Zakonitosti nasljeđivanja: Mejoza . U Osnove biologije stanice i genetike za medicinare. Medicinski fakultet, Zagreb, 1999.
Eksperimentalni dio:
1. Sekcija i preparacija muškog reproduktivnog sustava laboratorijskog štakora
2. Izolacija živih spermija
3. Sekcija i preparacija ženskog reproduktivnog sustava laboratorijskog štakora
Trajni preparati:
1.Presjek kroz testis štakora: spermatogeneza
2.Presjek kroz epididymis štakora: zreli spermiji
3.Presjek kroz ovarij štakora: oogeneza (primarni, sekundarni,tercijarni folikul)
4. testis ovarij žabe dvospolca
Pribor:
Pribor za anesteziju i sekciju
Predmetna i pokrovna stakalca
Fiziološka otopina
11. Rani embrionalni razvoj, embriotransfer
Početak embrionalnog razvitka u različitih vrsta. Zigota, brazdanje. Blastula, blastocista, implantacija.
Determinatori razvitka u citoplazmi jajne stanice, polarnost jajeta. Zametna plazma i spolne prastanice. Sivi polumjesec.
Jaje sisavaca, totipotentnost blastomera, razvojna sudbina blastomera. Jednojajčani blizanci. Alofeni miševi.
Eksperimentalna manipulacija ranim razvojnim stadijima zametka sisavaca, embriotransfer.
Tekst:
Škreb, N.: Oplodnja i početak embrionalnog razvoja, str. 16-19. Determinatori razvitka u citoplazmi jajne stanice. Str. 77-94 U Biološke osnove suvremene medicine, Školska knjiga, Zagreb 1991.
Eksperimentalni dio:
1. Brazdanje ježinca
Trajni preparati:
1.Blastula žabe
Video film: Embriotransfer u miša
Pribor: fiksirani zameci ježinca, pipete, predmetna, pokrovna stakalca, filter papir
Trudne mišice (3,5 dana trudnoće), šprice, zatupljene igle, fiziološka otopina, male petrijevke, braking pipete, binokularna lupa
12. Stadiji razvitka sisavaca, kritične faze, teratogeni, eksperimetalni modeli in vitro
Gastrulacija u različitih vrsta. Morfogenetska gibanja u organogenezi. Neurulacija. Interakcije među embrionalnim stanicama. Induktivne interakcije: primarna i sekundarne indukcije. Patologija indukcije. Propadanje stanica u morfogenezi.
Kritične etape embrionalnog razvitka u sisavaca. Teratogeni faktori (FAS, hiper i hipovitaminoza A, zračenje, talidomid).
Tekst:
Škreb, N.: Morfogenetska gibanja stanica u razvitku, str. 21-39. Interakcije među embrionalnim stanicama, str. 41-59. U Biološke osnove suvremene medicine, Školska knjiga, Zagreb, 1991.
Crnek-Kunstelj, V.: Genetička kontrola embrionskog razvitka, str. 1-5. U Osnove biologije stanice i genetike za medicinare, Medicinski fakultet, Zagreb, 2003.
Eksperimentalni dio:
1.Sekcija gravidne ženke štakora i preparacija uterusa
2.Izolacija fetusa i placenti
Trajni preparati:
1.Gastrula vodozemca
2.Zameci sisavca na stadiju primitivne pruge izolirani iz uterusa, obojeni i fiksirani
3.Zametni cilindar sisavca na stadiju primitivne pruge na presjeku kroz uterus
4.Neurula vodozemca
5.Zameci sisavca na stadiju neurule izolirani iz uterusa, obojeni i fiksirani
6.Fiksirani zameci sisavca 11, 13 i 14 dana starih
7.Razvitak udova: zametak čovjeka 5. i 8. tjedan gestacije
8.Malformacije zametka štakora uzrokovane 5-azacitidinom
Pribor:
Pribor za anesteziju i sekciju, zvono, eter, škare, pincete
Predmetna i pokrovna stakalca, Fiziološka otopina
13. Diferencijacija stanice
Rast i diferencijacija, diferencijalna aktivnost gena. Ekspresija specifičnih proteina stanice. Faktori rasta i diferencijacije. Hox geni u Drosophile, miša i čovjeka.
Trajni preparati:
1.Skeletni mišić
2.Crijevni epitel
3.Epidermis
4.Glatki mišić
14. Eksperimetalni tumori, teratomi, teratokarcinomi
Veza između kancerogeneze i diferencijacije. Eksperimentalni tumori: teratom, teratokarcinom. Nediferencirane stanice embrionalnog karcinoma.
Škreb, N.: Regulacija genske aktivnosti, str 95-120. Uloga jezgre u razvoju, str.60-76. U: Biološke osnove suvremene medicine, Školska knjiga, Zagreb, 1991.
Vlahović, M.: Kloniranje, Liječničke novine, Zagreb, 1998.
Pećina-Šlaus i sur: Odabrane metode molekularne biologije, Medicinska naklada, Zagreb, 2009.
Eksperimentalni dio:
Metode istraživanja embrionalnog razvitka sisavaca:
1.Kultura organa in vitro
2.Uzgajanje in vivo pod bubrežnom kapsulom – teratom (sekcija štakora i preparacija izraslog teratoma)
3.Tetarokarcinom in vivo pod bubrežnom kapsulom (sekcija miša i preparacija izraslog teratokarcinom)
Trajni preparati:
1. Teratom štakora
2. Teratokarcinom miša
3. Razmaz koštane srži čovjeka
4. Razmaz punktata tumora čovjeka
Pribor:
Instrumenti za sekciju, lupa, Zenker-ova otopina, pribor za anesteziju, Tyrode otopina, embriološke šalice, Pasteurove pipete, braking-pipete.
15. Zdravlja okoliša i ljudsko zdravlje
Pristupačnost